HPLC 칼럼 안정화, 베이스라인이 잡혀야 분석을 시작한다.

HPLC에서 칼럼을 퍼지했다고 바로 분석을 시작하는 것은 아니다.

퍼지가 끝났으면 이제 실제로 분석에 사용할 이동상을 칼럼에 흘려주면서 칼럼을 안정화시키는 과정이 필요하다.

쉽게 말하면 칼럼이 지금 사용할 이동상 조건에 적응할 때까지 기다리는 것이다.

퍼지가 끝났으면 분석 이동상을 흘려준다

먼저 퍼지가 완료되면 칼럼에 튜빙을 연결하고 분석에 사용할 이동상을 흘려준다.

이때 그냥 이동상만 흘려주고 시간을 기다리는 것이 아니라 압력과 베이스라인을 같이 확인해야 한다.

특히 이전에 같은 물질을 분석한 경험이 있다면 예전 분석에서 압력이 어느 정도 나왔는지 확인해 보는 것이 좋다.

예를 들어 같은 칼럼, 같은 유속, 비슷한 이동상 조건으로 분석했는데 예전에는 압력이 100 정도였는데 이번에는 시작부터 150, 180 이렇게 나온다면 한 번 확인해 볼 필요가 있다.

반대로 평소보다 압력이 너무 낮게 나온다고 해서 무조건 좋은 것도 아니다.

중요한 것은 절대적인 숫자 하나가 아니라 내가 사용하던 조건에서 평소와 비교해 어떤 변화가 있는지를 보는 것이다.

그래서 HPLC를 오래 사용하다 보면 압력도 자연스럽게 기록하게 된다.

이동상을 흘리면 검출기에 변화가 나타난다

분석 이동상을 흘리기 시작하면 검출기 화면에 흡광도 변화가 나타난다.

처음부터 아주 안정적인 직선이 나오는 경우도 있지만, 그렇지 않은 경우도 많다.

칼럼 안에는 앞서 사용했던 용매가 남아 있을 수 있고, 지금 흘려주는 이동상과 이전 용매의 조성이 다를 수도 있다.

그러다 보니 새로운 이동상이 칼럼 내부를 충분히 통과하면서 검출기에서 나타나는 신호도 계속 변할 수 있다.

이때 화면에 나타나는 그래프가 우리가 흔히 이야기하는 베이스라인(baseline), 즉 바탕선이다.

처음에는 올라가기도 하고 내려가기도 하고, 어느 정도 시간이 지나면서 점점 안정되는 모습을 보인다.

베이스라인이 잡힌다는 것은?

이동상만 계속 흘려주면서 어느 정도 시간이 지나면 베이스라인의 변화가 줄어든다.

그리고 일정한 수준에서 안정적으로 유지되는 상태가 된다.

이때 흔히

"베이스라인이 잡혔다."

또는

"칼럼이 안정화됐다."

라고 이야기한다.

결국 칼럼 안정화라는 것은 특별히 어려운 작업이라기보다 현재 분석에 사용할 이동상 조건으로 칼럼과 검출기 상태가 충분히 안정될 때까지 확인하는 과정이라고 생각하면 된다.

그런데 칼럼 안정화 시간이 항상 똑같지는 않다

HPLC를 하다 보면 "칼럼은 몇 분 정도 안정화시키면 되나요?"라는 질문을 받을 수 있다.

그런데 이걸 무조건 몇 분이라고 정해 놓고 생각하기는 어렵다.

칼럼에 어떤 용매가 들어 있었는지, 지금 어떤 이동상을 사용하는지에 따라 달라질 수 있기 때문이다.

예를 들어 이전에 사용하던 이동상과 지금 사용하는 이동상의 조성이 크게 다르다면 새로운 이동상으로 충분히 치환되는 데 시간이 더 필요할 수 있다.

검출기 파장에 따라서도 베이스라인의 모습이 달라질 수 있다.

특히 UV 검출기를 사용하는 경우에는 이동상 자체의 흡광 특성과 검출 파장에 따라서 베이스라인이 안정되는 모습이 달라질 수 있다.

그래서 단순히 "10분 흘렸으니까 됐다"라고 판단하기보다는 실제 화면에서 베이스라인이 어떻게 변하고 있는지를 확인하는 것이 중요하다.

 

 

 

 

 

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칼럼 안정화하면서 압력을 꼭 보자

개인적으로 HPLC 분석에서 상당히 중요하게 보는 것 중 하나가 압력이다.

시험 결과만 보고 있으면 압력은 그냥 장비 화면에 나오는 숫자처럼 보일 수 있다.

그런데 같은 분석을 반복해서 하다 보면 이 숫자가 상당히 유용하다.

예를 들어 동일한 칼럼으로 매번 같은 조건에서 분석을 한다고 해보자.

평소에는 비슷한 압력이 나오는데 어느 날 갑자기 압력이 높아졌다.

그렇다면 그냥 "오늘은 압력이 높네" 하고 넘어갈 것이 아니라 왜 그런지 확인해 볼 필요가 있다.

칼럼 자체의 상태일 수도 있고, 이동상이나 필터, 튜빙, 가드 컬럼 등 다른 부분에서 문제가 생겼을 수도 있다.

반대로 압력이 갑자기 낮아졌다면 연결 상태나 누액 등 다른 부분을 확인해야 할 수도 있다.

물론 압력 하나만 보고 칼럼의 이상 여부를 단정할 수는 없다.

하지만 과거 기록과 비교하면 이상 여부를 판단하는 데 상당히 좋은 참고자료가 된다.

그래서 나는 압력을 기록하는 것이 좋다고 생각한다

공정서나 시험일지에 압력을 반드시 기록하도록 되어 있지 않은 경우도 있다.

그렇다고 해서 기록할 필요가 없는 것은 아니다.

오히려 분석자가 나중을 위해 기록해 두면 상당히 유용하다.

예를 들어

같은 칼럼으로
같은 이동상을 사용하고
같은 유속으로
같은 조건에서 분석했는데

예전에는 압력이 120 정도였고 지금은 160이 나왔다면,

과거 기록이 있기 때문에 "예전과 달라졌다"는 것을 바로 알 수 있다.

그런데 기록이 없다면 160이라는 압력이 높은 것인지 원래 그런 것인지 판단하기가 애매해진다.

그래서 HPLC 분석을 오래 하다 보면 시험 결과뿐만 아니라 분석 당시 압력도 하나의 데이터로 생각하게 된다.

베이스라인이 잡혔다고 바로 끝나는 것도 아니다

베이스라인이 안정되었다면 이제 분석을 시작할 수 있다.

이때의 압력도 한 번 확인해 둔다.

그리고 가능하면 이전 분석에서의 압력과 비교한다.

특히 동일한 시험을 반복하는 QC 분석에서는 이런 기록이 나중에 상당히 도움이 된다.

"지난번에도 이 정도였나?"

"이번에 왜 압력이 올라갔지?"

"칼럼을 교체해야 하나?"

이런 판단을 할 때 결국 필요한 것은 과거의 기록이다.

HPLC 분석에서는 시험 결과만 남기는 것보다 분석 당시의 상태를 같이 기록해 두는 것이 좋다.

HPLC 분석은 시료를 주입하면서 시작되는 것이 아니다

HPLC를 처음 배울 때는 보통

시료를 준비하고 → 바이얼에 넣고 → 주입하고 → 크로마토그램을 확인하는 것에 집중하게 된다.

그런데 실제로는 그 전에 확인해야 할 것들이 많다.

퍼지가 제대로 되었는지,

분석 이동상이 제대로 들어가고 있는지,

압력이 평소와 비슷한지,

베이스라인이 안정되었는지,

칼럼이 분석 조건에 충분히 적응했는지를 확인하고 나서 시료를 주입한다.

결국 시료를 주입하는 순간이 분석의 시작이라기보다는, 안정적인 분석 조건을 만드는 것부터 이미 HPLC 분석이 시작된다고 볼 수 있다.

그리고 그 과정에서 가장 기본적으로 확인하는 것이 바로 칼럼 압력과 베이스라인이다.

처음에는 그냥 장비 화면에 보이는 숫자와 그래프로 생각할 수 있다.

하지만 여러 번 분석을 해보면 이 두 가지가 장비와 칼럼의 상태를 파악하는 데 꽤 중요한 정보라는 것을 알게 된다.

그래서 HPLC를 사용할 때는 "이동상을 흘렸으니 됐다"가 아니라 "베이스라인이 안정됐고, 압력도 평소와 비슷한가?"까지 확인하고 분석을 시작하는 습관을 들이는 것이 좋다.