HPLC 시스템적합성(System Suitability), 왜 시험 전에 반드시 확인해야 할까?

HPLC로 시험을 진행하다 보면 "장비 켰고, 컬럼 연결했고, 표준액도 준비했으니 바로 검체를 넣으면 되겠지"라고 생각하기 쉽습니다.

하지만 실제 GMP 환경에서는 검체 분석 전에 반드시 확인해야 하는 과정이 있습니다. 바로 시스템적합성(System Suitability) 시험입니다.

시스템적합성은 단순히 HPLC 장비가 정상적으로 켜져 있는지를 확인하는 절차가 아닙니다. 현재 설정된 시험조건에서 분석 시스템이 정상적으로 작동하고 있으며, 신뢰할 수 있는 시험결과를 얻을 수 있는 상태인지를 확인하는 과정입니다.

오늘은 HPLC 시스템적합성이 정확히 무엇을 확인하는 시험인지, 어떤 항목을 확인하는지, 그리고 왜 검체 분석보다 먼저 수행해야 하는지 정리해보겠습니다.

시스템적합성이란?

시스템적합성 시험은 시험장비, 전자 시스템, 분석조작 및 검체가 하나의 분석 시스템으로서 적절하게 작동하고 있는지를 확인하는 시험입니다.

쉽게 말하면,

"오늘 이 HPLC 시스템으로 얻은 시험결과를 신뢰해도 되는가?"

를 검체 분석 전에 확인하는 절차라고 생각하시면 됩니다.

HPLC는 펌프, 오토샘플러, 컬럼, 검출기, 데이터 처리 시스템 등이 서로 연결되어 하나의 분석 시스템을 구성합니다.

따라서 컬럼의 상태가 좋지 않거나 이동상 조성이 적절하지 않은 경우, 오토샘플러의 주입이 불안정하거나 검출 신호에 문제가 있는 경우에는 겉보기에는 정상적인 크로마토그램처럼 보여도 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 어려울 수 있습니다.

시스템적합성은 이러한 문제를 검체 분석 전에 확인하기 위한 일종의 품질관리 관문이라고 볼 수 있습니다.

시스템적합성에서는 무엇을 확인할까요?

HPLC 시스템적합성에서 확인하는 항목은 시험방법에 따라 달라질 수 있습니다.

대표적으로는 다음과 같은 항목들이 있습니다.

구분확인 목적주요 항목

시스템 성능	분리 및 피크 형태가 적절한지 확인	이론단수, 대칭계수, 테일링팩터, 용량계수, 분리도 등
시스템 정밀성	반복 주입 시 결과가 일정한지 확인	피크 면적 또는 높이의 RSD 등

여기서 중요한 점은 모든 HPLC 시험에서 위 항목을 전부 확인하는 것은 아니라는 것입니다.

시험의 목적과 시험방법에 따라 필요한 시스템적합성 항목과 허용기준이 다르게 설정될 수 있습니다.

따라서 실제 시험에서는 해당 시험방법에 설정된 시스템적합성 항목과 기준을 확인하는 것이 중요합니다.

1. 시스템 성능은 무엇을 확인할까요?

먼저 HPLC가 시험방법에서 요구하는 분리 성능을 제대로 나타내고 있는지를 확인합니다.

이론단수(N)

이론단수는 컬럼의 효율을 나타내는 대표적인 지표입니다.

일반적으로 이론단수가 높을수록 피크가 좁고 효율적으로 분리되는 경향이 있습니다.

반대로 이론단수가 기준에 미치지 못한다면 컬럼의 상태나 오염, 충진 상태 또는 분석조건 등에 문제가 있는지 확인할 필요가 있습니다.

물론 이론단수 하나만으로 컬럼의 상태를 판단하는 것은 아니며, 해당 시험방법에서 정한 기준과 기존 분석결과 등을 함께 확인해야 합니다.

대칭계수와 테일링팩터

HPLC 크로마토그램을 보면 피크가 깔끔하게 올라왔다가 내려오는 경우도 있지만, 피크의 뒤쪽이 길게 늘어지는 경우도 있습니다.

이러한 현상을 일반적으로 피크 테일링(Peak Tailing)이라고 합니다.

테일링이 심해지면 정량 결과에 영향을 줄 수 있고, 인접한 피크와의 분리에도 영향을 줄 수 있습니다.

따라서 시험방법에서 대칭계수 또는 테일링팩터에 대한 기준을 설정한 경우 이를 확인하게 됩니다.

실험실에서 HPLC 크로마토그램이 평소와 다르게 나타났을 때 확인해야 하는 대표적인 항목 중 하나입니다.

용량계수(k')

용량계수는 분석물질이 컬럼에서 얼마나 유지되는지를 나타내는 지표입니다.

분석물질의 유지시간은 컬럼과 이동상 조건 등에 따라 달라지기 때문에, 필요한 경우 시험방법에서 시스템 상태를 확인하기 위한 항목으로 활용할 수 있습니다.

분리도(Rs)

분리도(Resolution, Rs)는 서로 인접한 두 피크가 얼마나 잘 분리되어 있는지를 나타내는 지표입니다.

특히 주성분과 불순물처럼 서로 가까운 위치에서 용출되는 성분을 분석할 때 중요합니다.

두 피크가 충분히 분리되지 않는다면 각각의 성분을 정확하게 정량하기 어려울 수 있기 때문입니다.

따라서 불순물 시험이나 이성질체 분리와 같이 분리 성능이 중요한 시험에서는 분리도가 중요한 시스템적합성 항목으로 사용될 수 있습니다.

2. 시스템 정밀성은 왜 확인할까요?

시스템적합성에서는 시스템의 성능뿐만 아니라 반복 주입했을 때 결과가 일정하게 나오는지도 확인합니다.

동일한 표준액을 여러 번 주입하고 각각의 피크 면적 등을 비교하여 결과가 얼마나 일정하게 나타나는지를 확인하는 것입니다.

예를 들어 표준액을 반복 주입한 결과가 다음과 같다고 가정해보겠습니다.

1000 → 1002 → 998 → 1001 → 999 → 1000

각 주입 결과가 큰 차이 없이 일정하게 나타난다면 반복 주입에 대한 정밀성이 양호하다고 판단할 수 있습니다.

반대로,

1000 → 1080 → 950 → 1035 → 920 → 1070

처럼 결과가 크게 흔들린다면 단순히 검체의 문제가 아니라 주입 시스템이나 분석 시스템 자체의 상태를 확인해야 할 수 있습니다.

이러한 반복 주입 결과를 RSD(상대표준편차) 등으로 평가하여 시스템의 반복성이 적절한지를 확인합니다.

 

 

왜 검체 분석 전에 시스템적합성을 확인할까요?

시스템적합성을 이해할 때 가장 중요한 부분입니다.

예를 들어 저울을 사용해서 어떤 물질의 무게를 측정한다고 생각해보겠습니다.

저울 자체가 정상적으로 작동하지 않는 상태라면 아무리 정확하게 물질을 올려놓더라도 그 결과를 믿기 어려울 것입니다.

HPLC도 마찬가지입니다.

검체 자체에는 아무런 문제가 없더라도 컬럼, 주입 시스템, 이동상, 검출 시스템 등에 문제가 있다면 최종 시험결과에 영향을 줄 수 있습니다.

그래서 검체를 분석하기 전에 먼저 시스템적합성을 확인하는 것입니다.

일반적인 분석 흐름은 다음과 같이 생각하시면 됩니다.

HPLC 분석조건 설정
        ↓
시스템적합성 시험
        ↓
시스템적합성 기준 확인
        ↓
적합
        ↓
검체 분석

시스템적합성이 적합하다는 것은 단순히 "장비가 켜져 있다"는 의미가 아닙니다.

해당 시험방법에서 요구하는 조건을 만족하는 상태로 분석 시스템이 작동하고 있다는 것을 확인했다는 의미입니다.

시스템적합성이 부적합하면 어떻게 해야 할까요?

만약 시스템적합성 기준을 만족하지 못했다면 해당 상태에서 얻어진 검체 결과를 그대로 시험결과로 판단해서는 안 됩니다.

먼저 시스템적합성이 부적합하게 나타난 원인을 확인해야 합니다.

예를 들어 다음과 같은 부분을 확인할 수 있습니다.

• 컬럼의 상태
• 이동상 조제 상태
• 이동상 조성 및 pH
• 유속 및 컬럼 온도
• 오토샘플러 주입 상태
• 검출기 상태
• 시스템 압력
• 누설 여부
• 표준액 조제 상태
• 시험방법 설정 및 분석조건

원인을 확인하고 필요한 조치를 수행한 후, 해당 SOP와 시험방법에 따라 시스템적합성을 다시 확인하게 됩니다.

여기서 중요한 것은 단순히 "결과가 마음에 들지 않으니 다시 주입한다"는 방식으로 접근해서는 안 된다는 것입니다.

GMP 환경에서는 시스템적합성 부적합의 원인을 적절하게 확인하고 그 과정과 결과를 기록하는 것이 중요합니다.

시스템적합성 기준은 모든 시험에서 동일할까요?

실무에서 자주 오해하는 부분 중 하나입니다.

결론부터 말씀드리면 모든 HPLC 시험에 동일한 시스템적합성 기준을 적용하는 것은 아닙니다.

예를 들어 "RSD는 무조건 2.0% 이하" 또는 "시스템 정밀성은 항상 1.0% 이하"라고 생각하는 경우가 있습니다.

하지만 이러한 방식으로 모든 시험에 동일한 기준을 적용해서는 안 됩니다.

시스템적합성 항목과 허용기준은 해당 시험방법에 따라 설정됩니다.

따라서 실제 시험을 수행할 때는 해당 시험방법, 약전, 의약품각조, 허가사항, 밸리데이션 자료 및 승인된 시험방법서 등에 설정된 기준을 우선적으로 확인해야 합니다.

인터넷에서 흔히 볼 수 있는 일반적인 수치를 그대로 가져와 적용하기보다는 현재 수행하고 있는 시험방법에 규정된 시스템적합성 기준을 적용하는 것이 원칙입니다.

실험실에서는 이렇게 생각하면 쉽습니다

HPLC 시스템적합성을 어렵게 생각하실 필요는 없습니다.

결국 다음 네 가지 질문에 답하는 과정이라고 생각하시면 됩니다.

첫 번째, 컬럼이 제대로 분리하고 있을까요?

→ 이론단수, 테일링팩터, 대칭계수, 분리도 등을 확인합니다.

두 번째, 반복해서 주입해도 결과가 일정하게 나올까요?

→ 표준액 반복 주입 결과의 RSD 등을 확인합니다.

세 번째, 크로마토그램의 상태가 적절할까요?

→ 피크 형태와 분리 상태 등을 확인합니다.

네 번째, 현재 시스템에서 얻은 결과를 신뢰할 수 있을까요?

→ 시험방법에서 정한 시스템적합성 기준을 충족하는지 확인합니다.

결국 시스템적합성은 단순히 HPLC 장비만을 확인하는 시험이 아니라 현재의 분석 시스템이 해당 시험방법에 따라 신뢰할 수 있는 결과를 만들어낼 수 있는지를 확인하는 절차라고 볼 수 있습니다.

 

HPLC 분석에서 시스템적합성은 검체 분석 전에 확인해야 하는 중요한 QC 절차입니다.

컬럼이 정상적으로 분리하고 있는지, 피크 형태가 적절한지, 반복 주입 결과가 일정한지 등을 확인함으로써 분석 시스템의 상태를 점검할 수 있습니다.

특히 중요한 것은 시스템적합성 기준을 모든 시험에 동일하게 적용하지 않는 것입니다.

시험방법에 따라 필요한 평가항목과 허용기준이 다를 수 있기 때문에 실제 시험에서는 승인된 시험방법서와 관련 기준을 우선적으로 확인해야 합니다.

결국 시스템적합성은 단순한 형식적 절차가 아닙니다.

"이 HPLC 시스템에서 얻은 결과를 신뢰할 수 있는가?"

이 질문에 답하기 위한 과정입니다.

검체 분석을 시작하기 전에 시스템적합성을 확인하는 이유도 바로 여기에 있습니다.

아무리 좋은 HPLC 장비와 시험방법을 사용하더라도 실제 분석을 수행하는 시스템의 상태가 적절하지 않다면 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 어렵습니다.

따라서 HPLC 분석에서 시스템적합성은 시험결과의 신뢰성을 확보하기 위한 가장 기본적인 확인 절차라고 할 수 있습니다.

 

주요 기관별 HPLC 시스템적합성 관련 기준

앞에서 HPLC 시스템적합성이 무엇인지 살펴보았습니다.

그렇다면 실제 시험에서는 시스템적합성 기준을 어떻게 설정하고 적용할까요?

HPLC 시스템적합성과 관련해서 실무에서 가장 많이 참고하는 자료로는 미국약전(USP) <621> Chromatography와 ICH Q2 분석법 밸리데이션 가이드라인 등이 있습니다.

다만 여기서 주의해야 할 점이 있습니다.

USP의 시스템적합성 기준과 ICH의 분석법 밸리데이션 기준은 같은 개념이 아닙니다.

USP <621>은 크로마토그래피 시험에서 시스템적합성을 평가하기 위한 구체적인 항목과 계산방법을 제시하고 있고, ICH Q2는 분석법 밸리데이션에서 정확성, 정밀성, 특이성 등의 성능특성을 어떻게 평가할 것인지에 대한 원칙을 제시합니다.

따라서 두 기준을 단순히 "RSD 2.0% 이하"라는 하나의 숫자로 묶어서 이해하면 안 됩니다.

미국약전 USP <621> Chromatography

USP <621>은 크로마토그래피에 대한 일반장(General Chapter)으로, 시스템적합성(System Suitability)과 관련된 여러 평가항목과 계산방법을 제시하고 있습니다.

대표적으로 분리도(Resolution), 컬럼 효율(Column Efficiency), 테일링팩터(Tailing Factor), 시스템 정밀성(System Precision) 등을 평가할 수 있습니다.

특히 시스템 정밀성에 대해서는 표준액 또는 기타 표준용액을 반복 주입하여 정밀성 기준을 만족하는지를 확인하도록 하고 있습니다.

여기서 많이 알려진 것이 5회 주입과 6회 주입에 대한 규정입니다.

USP <621>에서는 개별 모노그래프에 별도의 규정이 없는 경우, 시스템 정밀성에 대한 요구되는 RSD가 2.0% 이하인 경우에는 분석대상물질의 5회 반복 주입 데이터를 사용하여 RSD를 계산하도록 하고 있습니다.

반대로 요구되는 RSD가 2.0%를 초과하는 경우에는 6회 반복 주입 데이터를 사용합니다.

따라서 다음과 같이 정리할 수 있습니다.

USP <621>의 조건RSD 계산에 사용하는 반복 주입

요구되는 RSD ≤ 2.0%	5회 주입
요구되는 RSD > 2.0%	6회 주입

여기서 중요한 것은 2.0%가 무조건적인 시스템적합성 허용기준이라는 의미가 아니라는 점입니다.

즉,

"USP에서는 HPLC 시스템적합성 RSD를 무조건 2.0% 이하로 한다."

라고 이해하면 정확하지 않습니다.

USP <621>에서 2.0%는 위와 같이 RSD 계산에 필요한 반복 주입 횟수를 결정하는 기준으로 사용되는 값입니다.

또한 개별 모노그래프에서 별도의 시스템적합성 기준을 정하고 있다면 해당 모노그래프의 요구사항을 우선적으로 확인해야 합니다.

USP <621>은 시스템적합성 평가에서 분리도와 컬럼 효율 등의 항목도 다루고 있으며, 특히 분리도는 인접하여 용출되는 성분이 충분히 분리되는지를 확인하는 중요한 지표입니다.

USP의 Assay에서 %RSD 기준이 별도로 정해져 있지 않은 경우

USP <621>에는 조금 더 구체적인 내용도 있습니다.

Drug Substance Assay에서 순수 물질의 함량이 100%이고 개별 모노그래프에 최대 %RSD가 별도로 규정되어 있지 않은 경우에는, 기준용액 반복주입에 대한 최대 허용 %RSD를 계산하는 방법을 제시하고 있습니다. 이 계산에는 모노그래프의 허용 함량 범위(B), 반복 주입 횟수(n), Student's t 값 등이 사용됩니다.

따라서 USP의 시스템 정밀성을 단순히 "RSD 2.0% 이하"라는 숫자 하나로 이해하기보다는 시험방법과 모노그래프에서 요구하는 조건에 따라 평가하는 체계로 이해하는 것이 정확합니다.

대한민국약전(KP) 및 국내 시험방법

국내 의약품 시험에서는 대한민국약전(KP), 개별 품목의 허가된 시험방법, 식품의약품안전처 관련 가이드라인 및 시험방법 밸리데이션 자료 등을 함께 확인해야 합니다.

여기서도 중요한 원칙은 동일합니다.

모든 HPLC 시험에 하나의 RSD 기준을 일률적으로 적용하는 것은 아닙니다.

실제 시험방법에서 시스템적합성 항목과 허용기준이 설정되어 있다면 해당 시험방법의 기준을 우선적으로 적용해야 합니다.

따라서 "국내에서는 HPLC 시스템적합성 RSD가 항상 1.0% 이하이다"와 같이 일반화하는 것도 주의할 필요가 있습니다.

특정 시험방법에서 RSD 1.0% 이하를 기준으로 설정했다면 해당 시험에서는 그 기준을 적용하는 것이 맞지만, 이것을 모든 HPLC 시험에 적용되는 대한민국의 공통 기준이라고 표현해서는 안 됩니다.

ICH Q2(R2)는 무엇을 규정하고 있을까요?

ICH Q2(R2)는 「Validation of Analytical Procedures」, 즉 분석법 밸리데이션에 대한 가이드라인입니다.

현재 ICH Q2(R2)는 분석법 밸리데이션에서 정확성(Accuracy), 정밀성(Precision), 특이성/선택성(Specificity/Selectivity), 검출한계, 정량한계, 직선성 및 범위 등의 성능특성을 평가하기 위한 원칙을 제시하고 있습니다.

그중 정밀성(Precision)은 동일한 균질 검체를 규정된 조건에서 여러 번 측정했을 때 결과가 서로 얼마나 가까운지를 나타내는 성능특성입니다.

ICH Q2(R2)에서는 정밀성을 크게 다음과 같이 구분하고 있습니다.

• Repeatability
• Intermediate precision
• Reproducibility

Repeatability는 동일한 조건에서 짧은 시간 간격으로 반복하여 측정했을 때의 정밀성을 평가하는 개념입니다.

여기서 중요한 부분이 있습니다.

ICH Q2(R2)는 모든 정량시험에 대해 "RSD 2.0% 이하"라는 하나의 공통 허용기준을 규정하고 있지 않습니다.

ICH Q2(R2)의 목적은 분석법이 의도한 목적에 적합한지를 입증하기 위해 필요한 성능특성을 평가하는 데 있습니다. 실제 밸리데이션에서는 시험의 목적과 분석법의 특성, 보고범위 등을 고려하여 적절한 평가방법과 acceptance criterion을 설정해야 합니다.

따라서 흔히 말하는

"ICH 기준은 RSD 2.0% 이하이다."

라는 표현은 정확한 설명이라고 보기 어렵습니다.

그렇다면 RSD 1.0%와 2.0%는 어디에서 나온 것일까요?

실무에서 HPLC 시스템적합성을 이야기할 때 RSD 1.0% 또는 2.0%라는 숫자를 자주 접하게 됩니다.

하지만 이 숫자들은 서로 다른 맥락에서 사용될 수 있습니다.

특히 USP <621>의 경우 2.0%는 5회 또는 6회 반복주입 데이터를 선택하는 기준점으로 명확하게 사용됩니다.

반면 특정 시험방법에서 RSD 1.0% 또는 2.0% 이하를 시스템적합성 허용기준으로 설정했다면, 그것은 그 시험방법에서 설정된 acceptance criterion으로 이해해야 합니다.

따라서 다음과 같이 구분해서 생각하는 것이 좋습니다.

구분의미

USP <621>의 2.0%	5회 또는 6회 반복주입 데이터 선택과 관련된 기준
시험방법에 설정된 RSD 기준	해당 시험에서 시스템적합성 적합 여부를 판단하는 acceptance criterion
ICH Q2(R2)의 Precision	분석법 밸리데이션에서 정밀성을 평가하기 위한 성능특성
RSD 1.0%	모든 HPLC에 공통 적용되는 국제적 기준으로 볼 수 없음

실제 QC 시험에서는 무엇을 우선해야 할까요?

결국 실험실에서 가장 중요한 것은 일반적인 숫자를 외우는 것이 아닙니다.

현재 수행하고 있는 시험에 어떤 시스템적합성 기준이 설정되어 있는지를 확인하는 것이 가장 중요합니다.

실제 시험에서는 일반적으로 다음과 같은 자료를 확인하게 됩니다.

① 개별 품목의 승인된 시험방법

해당 시험방법서에 시스템적합성 항목과 허용기준이 설정되어 있는지 확인합니다.

② 적용되는 약전 및 개별 모노그래프

USP, 대한민국약전 등 해당 시험에 적용되는 약전의 관련 내용을 확인합니다.

③ 시험방법 밸리데이션 자료

시스템적합성 기준이나 분석법의 정밀성 등이 어떻게 설정되었는지 확인합니다.

④ 관련 SOP 및 GMP 절차

실험실에서 승인된 절차에 따라 시스템적합성 시험과 결과 처리를 수행합니다.

결국 가장 중요한 원칙은 다음과 같습니다.

일반적인 RSD 숫자를 임의로 적용하는 것이 아니라, 해당 시험방법과 적용되는 공식 기준에서 정한 시스템적합성 요구사항을 우선적으로 적용해야 합니다.

 

HPLC 시스템적합성에서 RSD는 매우 중요한 평가항목 중 하나이지만, "RSD 2.0%"라는 숫자 하나만 가지고 시스템적합성을 판단해서는 안 됩니다.

USP <621>에서는 요구되는 RSD가 2.0% 이하인지 초과하는지에 따라 RSD 계산에 사용하는 반복 주입 횟수를 5회 또는 6회로 구분하고 있습니다.

반면 ICH Q2(R2)는 분석법 밸리데이션에서 정밀성(Precision)을 평가하는 원칙을 제시하는 가이드라인이며, 모든 정량시험에 RSD 2.0% 이하라는 공통 시스템적합성 기준을 제시하는 문서는 아닙니다.

따라서 HPLC 시스템적합성을 실무적으로 이해할 때는 다음과 같이 기억하시면 됩니다.

USP <621> → 크로마토그래피 시스템적합성의 구체적인 평가 및 계산방법

ICH Q2(R2) → 분석법 밸리데이션에서 정밀성 등 성능특성을 평가하는 원칙

개별 시험방법 → 실제 시험에서 적용할 시스템적합성 항목과 허용기준

이렇게 구분해서 이해하시면 RSD 1.0%, 2.0%와 같은 숫자를 잘못 일반화하는 것을 피할 수 있습니다.