HPLC 시료 전처리: 원심분리(Centrifugation) 방법과 RCF(g) 이해

깨끗한 시료를 얻기 위한 전처리 방법으로 시린지필터 대신 원심분리기(centrifuge)​를 이용할 수 있다.

원심분리는 고가의 시린지필터를 사용하지 않아도 되며, 필터 사용 시 발생할 수 있는 분석 대상 성분의 흡착을 걱정하지 않아도 된다는 장점이 있다. 그러나 원심분리 후에도 원심분리관 내부에는 침전물과 맑은 상층액이 함께 존재하므로, 상층액을 채취하는 과정에서 침전물이 혼입될 가능성이 있다. 따라서 원심분리 후 시료를 채취할 때는 각별한 주의가 필요하다.

 

원심분리를 이용한 시료 전처리

전처리된 시료를 코니컬튜브(conical tube) 또는 ​마이크로튜브(microtube, Eppendorf tube)에 넣고 원심분리한다. 원심분리가 완료되면 피펫 등을 이용하여 침전물이 섞이지 않도록 상층액을 조심스럽게 채취한 후 분석용 바이알에 옮긴다.

필요한 경우 원심분리 후 상층액을 다시 시린지필터로 여과하여 추가적인 입자 제거를 진행할 수도 있다.

원심분리 조건은 사용하는 시료와 원심분리기의 특성, 로터의 종류 등에 따라 달라질 수 있으므로 시험법 또는 공정서에 규정된 조건이 있다면 해당 조건을 우선적으로 적용해야 한다.

 

 

 

RPM보다 RCF(g) 값을 사용하는 이유

원심분리 조건을 설정할 때 흔히 rpm(revolutions per minute)​을 사용하지만, 서로 다른 원심분리기를 이용하여 동일한 원심분리 조건을 재현하고자 하는 경우에는 RCF(relative centrifugal force, 상대원심력), 즉 g 값​을 사용하는 것이 편리하다.

동일한 rpm으로 원심분리를 하더라도 원심분리기의 종류와 로터 크기에 따라 시료와 회전 중심축 사이의 거리인 반지름(r)​이 달라진다. 이에 따라 시료가 실제로 받는 원심력도 달라진다.

RCF는 다음 식으로 계산할 수 있다.

RCF = 1.119 × 10⁻⁵ × rpm² × r

• RCF: 상대원심력(relative centrifugal force, ×g)
• rpm: 분당 회전수(revolutions per minute)
• r: 회전 중심축에서 시료까지의 거리(cm)

 

 

 

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따라서 서로 다른 원심분리기를 사용하는 경우 단순히 rpm을 동일하게 설정하기보다는 RCF(g) 값을 기준으로 조건을 설정하는 것이 원심분리 조건의 재현성 측면에서 유리하다.

최근에는 대부분의 원심분리기에서 rpm과 g 값을 모두 표시할 수 있어 별도의 계산 없이 원하는 조건을 설정할 수 있다.

 

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일반적인 원심분리 조건

시험법에 별도의 원심분리 조건이 규정되어 있지 않은 경우, 일반적으로 다음과 같은 조건을 적용할 수 있다.

• 15 mL 코니컬튜브: 약 3,000 rpm, 10분
• 1.7 mL 마이크로튜브: 약 12,000 rpm, 10분

다만 위 조건은 일반적인 예시이며, 모든 시료에 동일하게 적용되는 것은 아니다. 시료의 특성과 침전물의 양, 입자 크기 등에 따라 충분한 분리가 이루어지지 않을 수 있다.

원심분리 후에도 상층액이 충분히 맑아지지 않거나 입자가 남아 있는 경우에는 원심분리 시간을 추가하거나 원심분리 조건을 조정할 수 있다. 필요에 따라 최종적으로 시린지필터를 이용한 여과를 추가하여 분석에 적합한 시료를 확보한다.

 

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시료 채취 시 주의사항

원심분리에서 중요한 것은 단순히 침전물을 형성하는 것뿐만 아니라 침전된 입자가 다시 상층액에 혼입되지 않도록 시료를 채취하는 것이다.

따라서 원심분리가 끝난 후에는 원심분리관을 불필요하게 흔들거나 이동시키지 않고, 침전물이 형성된 바닥 부분을 건드리지 않도록 피펫을 이용하여 상층액을 천천히 채취하는 것이 좋다.

특히 HPLC 분석에서는 미세한 입자가 주입될 경우 컬럼이나 시스템에 영향을 줄 수 있으므로, 시료의 상태를 확인한 후 필요하다면 추가 여과를 진행하는 것이 안전하다.