HPLC 분석에서 마지막 전처리 과정 중 하나 = 여과

여과(Filtration)

여과(Filtration)는 HPLC 분석에서 가장 중요한 전처리 과정 중 하나이다. HPLC는 매우 작은 입자나 미량의 불순물도 검출할 수 있는 고감도 분석장비이므로, 시료가 완전히 용해되어 있고 이물질이 제거된 상태여야 정확한 분석 결과를 얻을 수 있다. 만약 입자성 물질이 포함된 시료를 그대로 주입하면 컬럼이 막히거나 시스템 압력이 상승하고, 컬럼 수명이 단축될 뿐 아니라 분석 결과의 재현성에도 영향을 줄 수 있다.

일반적으로 검액과 표준액은 HPLC 바이알에 옮기기 전에 시린지필터(Syringe Filter) 를 이용하여 여과한다. 시린지필터는 멤브레인필터를 플라스틱 하우징에 장착한 형태로 제작되며, Millipore, Advantec, Agilent, Whatman, Sartorius 등 다양한 제조사에서 공급하고 있다. 시린지필터는 멤브레인 재질, 공경(Pore Size), 직경(Diameter) 으로 구분되며, HPLC에서는 일반적으로 0.22 μm 또는 0.45 μm의 공경, 13 mm 또는 25 mm의 직경 제품이 가장 많이 사용된다.

필터 선택 시 가장 중요한 요소는 멤브레인 재질이다. 많이 사용되는 재질은 Nylon, Cellulose, PVDF, PTFE 등이 있으며, 각각 화학적 특성이 다르기 때문에 시료의 성질에 맞게 선택해야 한다. 약전이나 시험법에서는 대부분 필터의 공경만 규정하고 재질은 별도로 지정하지 않는 경우가 많으므로, 분석자가 각 재질의 특성을 이해하고 적절한 필터를 선택하는 것이 중요하다.

일반적으로 수용성 시료는 Nylon 또는 Cellulose 계열 필터를 사용하며, 유기용매가 약 20% 이상 포함된 시료는 PVDF 재질을 사용하는 경우가 많다. 최근에는 PVDF와 PTFE에 친수성(Hydrophilic) 또는 소수성(Hydrophobic) 특성을 부여한 제품이 개발되어 수용성 시료와 유기용매 시료 모두에 사용할 수 있는 제품도 널리 사용되고 있다.

부적절한 필터를 선택하면 다양한 문제가 발생할 수 있다. 예를 들어 Cellulose 계열 필터를 유기용매에 사용하면 멤브레인이 손상되거나 용해될 수 있으며, 녹은 필터 성분이 시료를 오염시키거나 분석을 방해할 수 있다. 반대로 소수성 PTFE 필터는 물과 같은 수용성 용매가 잘 통과하지 않기 때문에 메탄올 등으로 먼저 필터를 활성화(Activation)한 후 사용해야 하는 경우가 있다.

또한 일부 분석물질은 멤브레인에 흡착되어 실제 농도보다 낮게 측정될 수 있다. 이러한 흡착 여부는 시린지에 약 5~10 mL의 시료를 넣고 2~3 mL씩 순차적으로 여과한 후 각 여액을 분석하면 확인할 수 있다. 초기 여액의 분석값이 낮고 뒤로 갈수록 농도가 증가한다면 분석 대상물질이 멤브레인에 흡착되고 있음을 의미한다. 이는 초기에는 분석물질이 멤브레인에 흡착되다가 일정량 이상 흡착이 포화되면 이후부터는 정상 농도로 검출되기 때문이다. 이러한 현상이 확인되면 다른 재질의 필터를 사용하거나, 여과한 시료와 원심분리한 시료를 비교 분석하여 흡착 여부를 확인하는 것이 바람직하다.

 

 

 

 

 

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멤브레인 재질의 선택

시린지필터는 동일한 공경(Pore Size)이라도 멤브레인의 재질에 따라 화학적 특성과 용도가 다르다. 따라서 시료의 용매 조성, 분석 대상물질의 특성, 단백질 흡착 여부 등을 고려하여 적절한 재질을 선택해야 한다.

① Nylon

Nylon은 가장 범용적으로 사용되는 멤브레인이다. 수용성 시료의 여과에 적합하며 HPLC 분석에서 가장 많이 사용되는 재질 중 하나이다. 기계적 강도가 우수하고 다양한 시료에 적용할 수 있지만, 단백질과의 흡착이 비교적 커 단백질 분석에는 적합하지 않다. 또한 강산이나 강염기에는 내성이 낮은 편이다.

② PTFE (Polytetrafluoroethylene)

PTFE는 매우 뛰어난 내화학성을 가지는 소수성(Hydrophobic) 멤브레인이다. 대부분의 유기용매, 강산, 강염기에 사용할 수 있으며 고온에서도 안정성이 높다. 다만 물과 같은 수용성 용액은 잘 통과하지 않기 때문에 일반 PTFE 필터를 사용할 경우 메탄올 등으로 먼저 활성화(Pre-wetting)해야 한다. 최근에는 친수성 PTFE 제품도 출시되어 수용성 시료에도 사용할 수 있다.

③ PVDF (Polyvinylidene Fluoride)

PVDF는 수용성과 유기용매 모두 사용할 수 있는 재질로 활용 범위가 넓다. 특히 단백질 흡착이 낮아 단백질이나 생체시료 분석에 많이 사용된다. 일반적인 HPLC 분석뿐 아니라 LC-MS 분석에서도 많이 선택되는 재질이며, 유기용매가 포함된 시료를 여과할 때 가장 많이 사용된다.

④ Polypropylene (PP)

Polypropylene은 화학적 내성이 우수하며 단백질 분석에도 사용할 수 있는 재질이다. 주로 수용성 시료 여과에 사용되며 다양한 화학물질에 안정성을 가진다.

⑤ Cellulose Acetate (CA)

Cellulose Acetate는 친수성 멤브레인으로 수용성 시료의 여과에 적합하다. PVDF보다 단백질 흡착이 낮아 단백질 시료에도 사용할 수 있으며, 조직세포 배양이나 미생물 분야에서도 많이 활용된다. 다만 유기용매에는 적합하지 않은 경우가 많으므로 용매 조성을 확인해야 한다.

⑥ PES (Polyethersulfone)

PES는 단백질과 핵산의 흡착이 매우 낮아 생명과학 분야에서 널리 사용된다. 이온크로마토그래피, 조직배양, 핵산 추출, 생체 검체 여과 등에 적합하며, 빠른 유속과 높은 처리량이 장점이다.

⑦ RC (Regenerated Cellulose)

RC는 수용성과 유기용매 모두 사용할 수 있는 친수성 멤브레인이다. 화학적 안정성이 우수하며 단백질 흡착이 낮아 생체시료와 일반 HPLC 분석에 널리 사용된다. 다양한 용매에 적용할 수 있어 범용성이 높은 재질이다.

⑧ GMF (Glass Microfiber)

GMF는 유리섬유 재질의 심층여과(Depth Filtration)용 필터이다. 입자가 많은 시료를 1차로 제거하거나 침전물이 많은 시료를 전처리할 때 사용하며, 일반 멤브레인 필터의 막힘을 줄이는 전처리용 필터로 많이 활용된다.

 

멤브레인	특징	주요 용도
Nylon	범용, 수용성, 기계적 강도 우수	일반 HPLC 분석
PTFE	소수성, 유기용매 및 강산·강염기 사용 가능	유기용매 여과
PVDF	수용성·유기용매 모두 가능, 단백질 흡착 낮음	HPLC, LC-MS, 생체시료
PP	화학적 내성 우수	수용성 시료
CA	친수성, 단백질 흡착 낮음	세포배양, 생명과학
PES	매우 낮은 단백질 흡착	단백질, 핵산, IC
RC	친수성, 범용성 우수	수용성·유기용매 모두
GMF	심층여과, 큰 입자 제거	전처리용

 

핵심 정리

• 여과는 HPLC 분석 전 반드시 수행하는 기본 전처리 과정이다.
• 목적은 입자성 불순물을 제거하여 컬럼과 장비를 보호하고 정확한 분석 결과를 얻는 것이다.
• 일반적으로 0.22 μm 또는 0.45 μm 시린지필터를 사용한다.
• 필터 선택 시 공경뿐만 아니라 멤브레인 재질도 매우 중요하다.
• 수용성 시료는 Nylon 또는 Cellulose, 유기용매가 포함된 시료는 PVDF, 겸용인 RC를 주로 사용한다.
• 잘못된 필터를 사용하면 멤브레인 손상이나 분석물질 흡착으로 인해 분석 오차가 발생할 수 있다.
• 새로운 시험법을 적용할 때에는 필터 흡착 여부를 반드시 확인하는 것이 바람직하다.